la fissazione dell'azoto

 

Definita anche riduzione assimilativa dell'azoto gassoso, è una idrogenazione essenziale per la biosfera, pur senza sottovalutare la fotosintesi: infatti la fissazione del carbonio è solo una delle tre tappe critiche nella sintesi globale delle proteine; le altre due sono la riduzione dell'azoto e quella dello zolfo.

Solo la riduzione del carbonio richiede la presenza di piante verdi e di luce solare; le altre due si svolgono solitamente in condizioni anaerobiche, in ambienti come terreno e fanghi privi di ossigeno, e sono attività limitate ad alcuni ceppi di microrganismi, i microorganismi_fissatori_dell’azoto.

La reazione di azotofissazione biologica, catalizzata dal complesso_enzimatico_nitrogenasi è, sinteticamente:

N2 + 8H+ + 6e ® 2NH4+

In effetti il processo avviene attraverso diversi stadi_di_riduzione_dell’azoto.

L'attività della nitrogenasi è regolata con un controllo a feed back dall'ammoniaca, la cui presenza reprime l'attività del gene nif (regolazione_della_fissazione_dell’azoto).

 

 

 

 

 

 


Microorganismi fissatori dell'azoto

La capacità di fissare l'azoto si osserva in un piccolo numero di microorganismi procarioti, batteri e cianobatteri.

I batteri_azotofissatori possono vivere sia liberi che in simbiosi, molti generi sono eterotrofi, altri autotrofi.

Fra gli eterotrofi alcuni generi sono anaerobi obbligati, (per esempio Clostridium), altri aerobi facoltativi (per esempio Klebsiella), altri ancora aerobi (per esempio Azotobacter).

I batteri autotrofi presentano un tipo primitivo di fotosintesi, ricavando sia il carbonio che l'azoto dall'aria (come il Rhodospirillum).

Fra i batteri che vivono in simbiosi, i più importanti e specializzati appartengono al genere Rhizobium, che formano noduli radicali in molte specie di leguminose.

Tutti i microorganismi capaci di fissare l'azoto sono provvisti di un sistema enzimatico denominato nitrogenasi.

 

 

 


Batteri azotofissatori

In generale si possono distinguere due grandi gruppi: i batteri liberi e i batteri simbiontici (che vivono cioè in simbiosi con altri organismi).

Tra i batteri liberi, per esempio, azotobacter, klebsiella, clostridium, rhodospirillum.

Tra i batteri simbiontici, anabaena, nostoc, citrobacter, oltre al gruppo dei rhizobium che sono simbionti delle leguminose (come soia, trifoglio, erba medica).

Altre ulteriori classificazioni possono distinguere questi batteri in aerobici e anaerobici.

 

 

 

 


Clostridium

Il genere clostridium comprende batteri anaerobi più o meno stretti, chemioorganotrofi, sporigeni.

Alcune specie sono azotofissatrici, altre proteolitiche.

Hanno forma a bastoncino e sono generalmente mobili.

Hanno notevole capacità di adattamento e possono essere annoverati fra le specie più attive specialmente nei terreni forestali.

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Azotobacter

E' il più importante genere di microorganismi azotofissatori, chemioorganotrofi e strettamente aerobi.

Hanno forma a bastoncino più o meno ovoidale di 2 micron di diametro e di lunghezza variabile. Sono mobili per mezzo di flagelli o immobili.

Si presentano singolarmente, in coppie o in aggregati irregolari.

Non formano spore, ma talvolta cisti.

Possono produrre abbondanti quantità di muco capsulare e fissano l'azoto in maniera non simbiontica.

Sono diffusi in acque e suoli con temperatura ottimale 20 -30 °C.

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Rhodospirillum

I batteri Rhodospirillum sono policromi, rossi, verdi e bruni,essendo dotati di batterioclorofilla e di differenti tipi di pigmenti carotenici.

Nella loro attività fotosintetica il riducente non è l'acqua ma l'acido solfidrico. L'azotofissazione è associata alla fotosintesi.

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Nella figura sopra un rhodospirillum al microscopio; in quella sottostante un ingrandimento della parte evidenziata dal rettangolo viola; in questo ingrandimento si vedono più chiaramente le membrane_fotosintetiche_dei_batteri.

Condizioni fondamentali per il loro sviluppo sono anaerobiosi e luce.

Perciò sono presenti negli stagni, nelle fanghiglie al fondo dei bacini lacustri, nei terreni sommersi e nelle acque di scarico.

 

 

 

 

 


Rhizobium

I batteri Rhizobium (nella figura sottostante un ingrandimento al microscopio) sono chemiorganotrofi con metabolismo respiratorio ed aerobi.

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Hanno forma a bastoncino, di 0,5-0,9 micron; sono mobili per mezzo di 2-6 flagelli o di un flagello polare;inoltre sono asporigeni.

Possono invadere i peli radicali delle leguminose e stimolare la produzione di noduli detti tubercoli_radicali, in cui i batteri si presentano come simbionti intracellulari (batteroidi).

I batteroidi dei tubercoli fissano l'azoto molecolare in forme combinate utilizzabili dalle piante ospiti e usano i metaboliti prodotti dalla pianta come fonte di energia.

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Nella figura soprastante, una radice al microscopio, in cui sono visibili i peli radicali

 

 

 

 

 


Tubercoli radicali

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Nelle figure compaiono, in sequenza, una fotografia (grandezza naturale) di un gruppo di radici di leguminose, l'ingrandimento di un radice che evidenzia i tubercoli, la sezione ancora più ingrandita di un tubercolo radicale.

La formazione_di_tubercoli_radicali è dovuta a un processo biochimico che crea modificazioni anche fisiche nella radice.

 

 

 


Membrane fotosintetiche dei batteri

Nei batteri i processi sono analoghi a quelli dei mitocondri.

Le membrane fungono da supporto ai pigmenti e creano dei compartimenti indispensabili a mantenere un gradiente di protoni.

Nel disegno è evidenziata la formazione di tale gradiente protonico.

Nella maggior parte dei batteri fotosintetici le membrane che possiedono i fotosistemi e i loro trasportatori associati sono sospese nel citoplasma in forma di sacchi chiusi, sferici o appiattiti.

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Formazione di tubercoli radicali

Il processo di formazione comporta profonde modificazioni sia della radice sia del Rhizobium.

Le radici delle leguminose, crescendo, secernono nel terreno sostanze che stimolano la moltiplicazione dei batteri. I batteri elaborano l'acido beta-indolacetico (in figura) che provoca un caratteristico incurvamento ad uncino del pelo radicale della leguminosa.

A questo punto i rizobi, se appartengono al ceppo adatto, penetrano nella radice attraverso i peli; quindi si moltiplicano velocemente e si allineano lungo l'asse del pelo stesso.

Qui i batteri vengono racchiusi in un tubo di cellulosa e pectina prodotti dalla cellula vegetale.

Il tubo porta l'infezione nelle cellule interne parenchimatiche, dove i batteri si trasformano in forme rigonfie definite batteroidi.

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Le cellule reagiscono all'invasione moltiplicandosi e formando quel nodulo che chiamiamo tubercolo radicale.

All'interno dei noduli i batteroidi fissano l'azoto e lo incorporano negli amminoacidi.

Nei tessuti è presente la leg-emoglobina, un pigmento rosso che non si riscontra nè nella cellula batterica nè nella cellula vegetale.

 

 


Leg-emoglobina

E' molto simile all'emoglobina umana (la cui struttura compare nella figura), che è una proteina al cui interno è coordinato uno ione Fe: questo, nelle posizioni apicali (sopra e sotto il piano della molecola) può coordinarsi ulteriormente con O2, CO2, ma anche con CO, ioni CN-, etc. Nel primo caso esplica le funzioni di trasporto di O2 nell'organismo e di CO2 ai polmoni; nel secondo caso, la sua funzione può venire bloccata poiché CO e CN- si legano più fortemente di O2: ciò può provocare anossia e anche morte dell'organismo.

Si ritiene che la leg-emoglobina permetta di regolare la velocità con cui l'ossigeno raggiunge i batteri azotofissatori. Una quantità eccessiva di ossigeno inattiva l'enzima catalizzatore dell'azotofissazione, forse perchè la molecola di azoto e la molecola di ossigeno sono simili fra loro quanto a dimensioni e forma.

La leg-emoglobina possiede una alta affinità per l'ossigeno, e abbassa perciò significativamente la concentrazione di ossigeno libero.

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La leg-emoglobina serve per il trasferimento ai batteroidi dell'ossigeno loro necessario per la formazione dell'ATP, che fornisce poi l'energia per la riduzione dell'azoto.

 

 

 

 

 


Cianobatteri

Noti anche come alghe azzurre, costituiscono un gruppo di procarioti ben definito: tutte le specie fissano CO2 tramite fotosintesi, alcune anche N2.

Sono provvisti di clorofilla e di ficocianina, un pigmento azzurro, e la loro parete cellulare è simile a quella dei batteri. Si riproducono per semplice divisione cellulare. Sono diffusi ovunque, nelle regioni artiche, negli oceani, nei laghi, nelle acque termali e alcuni anche in ambienti terrestri umidi. Alcune specie formano la componente algale di alcuni licheni.

In alcune specie gli individui vivono isolati, in altre formano colonie filamentose, e sono i più attivi. In alcune di queste colonie compaiono, ad intervalli irregolari sul filamento, cellule speciali, più grosse, piene di materiale omogeneo e con parete più spessa. Tali cellule vengono chiamate eterocisti.

L'azotofissazione nei cianobatteri può avvenire sia in condizioni anaerobiche (in alcuni ceppi unicellulari e in molti ceppi filamentosi come per Oscillatoria) sia in condizioni aerobiche (in pochi ceppi filamentosi con eterocisti come per Anabaena e Nostoc)

I cianobatteri comprendono circa 40 specie. I generi principali sono Nostoc, Rivularia, Anabaena.

 

 

 

 

 


Clorofilla

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Nostoc, Anabaena, Rivularia

Nostoc e Anabaena sono generi coloniali nei cui filamenti sono intercalate cellule differenziate in eterocisti.

Nostoc è comunissimo e comprende numerose specie che possiamo osservare nelle acque, sulla terra, tra le erbe dei prati, soprattutto in terreni calcarei dove formano caratteristiche masserelle gelatinose di colore verde azzurrastro.

Le specie più frequenti di cianobatteri nel suolo appartengono a questo genere.

Anabaena è distinguibile dal Nostoc per il minore spessore dei mantelli gelatinosi. Talune sue specie si moltiplicano abbondantemente alla superficie delle acque, così da formare il noto Flos aquae. Alcune specie di Anabaena vivono in associazione con le radici delle Cycadeae e con le foglioline di Azolla, una felce acquatica.

Rivularia è costituita da filamenti che terminano da un lato con eterocisti e dall'altro si prolungano in una sequenza di individui sempre più piccoli.

 

 

 

 


Complesso enzimatico nitrogenasi

La nitrogenasi è formata da due componenti proteiche (componente I e componente II).

La componente I, chiamata Fe-Mo-proteina, contiene in totale 24 atomi di ferro, di cui alcuni sono condivisi con il cofattore contenente due atomi di molibdeno; è formata da due tipi di subunità ed ha un peso molecolare di circa 220000 u.m.a.

La componente II, chiamata Fe-proteina o azotoligasi-riduttasi è formata da due subunità identiche; contiene 4 atomi di ferro e 4 atomi di zolfo ed ha un peso molecolare di 65000 u.m.a.

Per l'attività è necessaria la presenza di forti riducenti_per_la_nitrogenasi, oltre che di ATP.

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Esistono specifiche condizioni per il funzionamento della nitrogenasi.

 

 

 

 

 


Riducenti per la nitrogenasi

Sono necessari riducenti forti, la ferridossina e la flavodossina ridotte, due proteine a basso peso molecolare (6000 e 24000 u.m.a. rispettivamente), con potenziale redox molto negativo (-420 mV).

Queste fungono da trasportatori di elettroni: quando hanno ceduto elettroni alla nitrogenasi devono essere rigenerate, cioé nuovamente ridotte.

Gli elettroni per la loro riduzione sono prodotti da altre reazioni metaboliche: negli organismi eterotrofi possono essere ottenuti da substrati organici attraverso processi fermentativi o respiratori; negli organismi fotosintetici derivano invece da donatori di elettroni della fotosintesi.

Nei microrganismi anaerobi stretti la ferridossina reagisce direttamente con la nitrogenasi mentre negli aerobi la riduzione è mediata dalla flavodossina.

 

 

 

 


Stadi di riduzione dell'azoto

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La ferridossina ridotta (che funge da trasportatore di elettroni) cede elettroni alla Fe-proteina (II) e la riduce.

Questa lega Mg ad ATP e può così cedere a sua volta elettroni alla Fe-Mo-proteina (I).

Fe-Mo-proteina (I) infine cede elettroni all'azoto molecolare N2 e lo riduce ad ammoniaca NH3.

Carboidrato e NH3 formano poi gli amminoacidi.

 

 

 

 

 


Condizioni per il funzionamento della nitrogenasi

Esigenze essenziali:

- presenza di tracce di Fe e Mo per la sintesi dell'enzima;

- presenza di processi metabolici che liberano elettroni per la riduzione dell'azoto, e di ATP per il fabbisogno energetico;

- presenza di ioni magnesio;

- assenza di H+ che verrebbero trasformati dalla nitrogenasi in idrogeno gassoso, danneggiando il riduttore;

- temperature compatibili con la crescita di batteri mesofili, poiché l'enzima altrimenti non è attivo;

- assenza di ossigeno, che inattiva irreversibilmente l'enzima.

Anche i microorganismi aerobi hanno a disposizione numerosi meccanismi di protezione della nitrogenasi dall'ossigeno.

 

 

 

 


Meccanismi di protezione della nitrogenasi dall'ossigeno

La nitrogenasi è inattivata da O2: per questo è particolarmente diffusa in batteri anaerobi obbligati e facoltativi.

I batteri aerobi che possono fissare l'azoto mettono in atto artifici metabolici (ad es.un'attività respiratoria intensa) che riescono a mantenere bassa la concentrazione di ossigeno nella cellula.

In alcuni cianobatteri che vivono in colonie filamentose la fissazione avviene solo in speciali cellule (eterocisti) che non producono ossigeno e sono rivestite da una spessa parete impermeabile ai gas.

Lo scambio di materiali con le cellule vicine è assicurato da connessioni citoplasmatiche.

Un caso particolare è quello dei batteri simbionti delle leguminose: nei tubercoli_radicali ove sono presenti, la concentrazione di ossigeno viene mantenuta bassa e controllata da una proteina che lega l'ossigeno, la leg-emoglobina.

 

 

 

 


Regolazione della fissazione dell'azoto

Come avviene anche per le altre, le proteine della nitrogenasi si possono formare solo se nel DNA del nucleo è presente il gene responsabile della loro sintesi; in questo caso si chiama gene nif (da NItrogen Fixation).

L'ammoniaca, prodotto della nitrogenasi, reprime l'attività_del_gene_nif, ed è perciò regolata con controllo a feed back, essenziale per l'attività dell'enzima. Quando si forma una quantità sufficiente di prodotto, l'attività dell'enzima non è più necessaria, perciò ne viene repressa la formazione dal prodotto stesso.

Questo avviene sia per l'attività della nitrogenasi, sia per aggiunta artificiale di ammonio (fertilizzanti).

Questo fenomeno ha importanti conseguenze ecologiche: in un ambiente con sufficienti composti azotati non viene fissato ulteriore azoto atmosferico. La fissazione si realizza soltanto quando si esauriscono le riserve di sostanze azotate. Questo meccanismo regolatore evita qualsiasi accumulo di sali azotati nell'ambiente.

 

 


Attività del gene nif

I geni nif codificano la nitrogenasi, perciò anche la fissazione dell'azoto.

L'enzima regolatore è la glutammina sintetasi.

L'ammoniaca dovuta alla fissazione si combina col glutammato dando gli amminoacidi.

Questi, se in eccesso, inibiscono l'enzima che, a sua volta, controlla i nif.

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